Uno de los análisis más solicitados a los laboratorios microbiológicos medioambientales sigue siendo el del género Legionella y sus especies, especialmente Legionella pneumophila.
Su detección o recuento sigue siendo el análisis por excelencia requerido por muchas empresas que tienen que vigilar sus instalaciones del riesgo de contener Legionella, y que han de seguir las directrices marcadas por el Ministerio de Sanidad y Consumo en el Real Decreto 865/2003.
La investigación llevada a cabo por GAMASER tiene su origen, precisamente, en su total orientación al cliente y, sobre todo, en su vocación de servicio. Tal y como asegura su director general, Elías Colom:
Por ello, según Colom ‘una vez analizadas todas las ventajas e inconvenientes de las técnicas analíticas existentes, decidimos emplear la qPCR para desarrollar nuestro estudio porque queríamos ofrecer inmediatez a la hora de dar los resultados de legionela y, sobre todo, que éstos correspondan a células vivas’.
La Legionella, objetivo alcanzable
La bacteria ambiental Legionella pneumophila y otras especies del mismo género son los agentes causantes de la legionelosis, una de las más graves enfermedades pulmonares que existen actualmente. Es especialmente agresiva en ancianos y en niños, en enfermos pulmonares, en diabéticos y, en general, en todas aquellas personas que tienen su sistema inmunológico comprometido.
El riesgo de contraer legionelosis depende del tipo e intensidad de la exposición y del estado de salud de las personas afectadas y puede llegar, incluso, a causar una importante tasa de mortalidad (entre un 10% y un 20%).
Las instalaciones de riesgo son controladas por las autoridades sanitarias con el Real Decreto 865/2003 de 4 de Julio, por el que se establecen los criterios higiénico-sanitarios para la prevención y control de la legionelosis, emitido por el Ministerio de Sanidad y Consumo.
Por la importancia y gravedad que tiene este patógeno en la salud pública, numerosos y constantes análisis se solicitan para su detección o recuento. En la mayoría de los casos es fundamental dar resultados rápidos y, si se producen brotes o casos positivos, esta premura se acentúa aún más puesto que se hace necesario tomar acciones con suma urgencia.
Es por ello que, empleando los métodos clásicos de cultivo que, por otro lado, son los únicos legislados por las autoridades sanitarias de nuestro país, son necesarios largos períodos de incubación (entre 10-15 días). Mediante el cultivo sólo se pueden cuantificar las unidades formadoras de colonias crecidas en el medio de cultivo, es decir, aquellas células que han podido reproducirse y dar como resultado una colonia: son las llamadas células “Viables cultivables”. Pero, en cambio, no se pueden cuantificar aquellas que están en la muestras pero no han podido producir dichas colonias, aunque se trate de células que mantienen sus funciones vitales e infectivas: son las que se llaman “Viables no cultivables”.
Esto se traduce en la obtención de resultados subestimados y, lo que es peor, se pueden dar posibles resultados falsos negativos. Frente a estos métodos clásicos de siembra, los métodos moleculares ofrecen una alternativa a los ensayos clásicos de Legionella. Los más conocidos son el Recuento directo de células viables combinado con un fluoróforo marcador y posterior identificación y recuento (DVC-FISH) y la Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
Tras estudiar todas las ventajas e inconvenientes de ambas técnicas, los investigadores de GAMASER decidieran emplear la qPCR para desarrollar su estudio, porque aporta rapidez en la obtención de resultados, incluso cuando se tengan que realizar y procesar muchas muestras al mismo tiempo.
¿Qué es la qPCR?
Se trata de un método enzimático que se emplea para la amplificación del DNA “in vitro” una vez lo hemos extraído de la célula. Según nos cuenta la Responsable de Microbiología de GAMASER, Adela Soriano, ‘‘el ensayo se lleva a cabo en un termociclador que proporciona ciclos repetidos de cambios de temperatura. Durante esos ciclos y en un corto período de tiempo, se amplifican niveles muy bajos de DNA diana hasta obtener millones de copias. La PCR se acopla a la emisión de una señal fluorescente. Esta señal se intensifica proporcionalmente a la cantidad de producto de PCR generado en cada ciclo de reacción’’.
Los objetivos fijados por Gamaser para este estudio, han sido los siguientes:
Investigar una forma rápida y eficiente que garantizase resultados en la detección de Legionella Viable con la finalidad de que pudieran tomarse acciones con la mayor celeridad posible, empleando para ello el método de qPCR en aguas de red puesto que son las que más solicitadas y ofrecer resultados de viabilidad con dicho método.
Ofrecer a la Administración un nuevo método oficial de análisis de Legionella Viable.
Para trabajar con la qPCR viable, es decir, la detección de material genético sólo correspondiente a células vivas, GAMASER ha trabajado conjuntamente con el personal del Instituto de Ingeniería y Medio Ambiente (IIAMA) de la universidad Politécnica de Valencia dirigido por el doctor Jose Luis Alonso Molina, como expertos que son en esta materia desde hace años.
Para estudiar la viabilidad celular existen métodos que están basados en:
1.- La actividad metabólica de las células
2.- La integridad celular de la membrana celular)
3.- La presencia de ácidos nucleicos marcados con fluoróforos
Todas las pruebas se realizaron inoculando concentraciones conocidas de células viables de Legionella pneumophila provenientes de colonias crecidas in vitro en nuestro laboratorio y con menos de 24 h de vida. Para discriminar las células que estaban vivas de las muertas, empleamos dos fluoróforos (SYTO9:PI) que permiten diferenciar las células vivas en color verde y las células muertas en color rojo. Así se pudieron preparar muestras problema añadiendo las concentraciones deseadas de células en cada caso.
Posteriormente, prepararon muestras con células vivas y otras con células muertas con y sin PMA respectivamente. De todas las concentraciones de PMA estudiadas, sólo la de 50 µM producía una inhibición total de la señal de fluorescencia en la PCR para las células inoculadas muertas y no tenía repercusión en las concentraciones de células vivas.
Legionella spp (aguas de red)
La siguiente y última fase del experimento consistió en comprobar que dicha concentración de PMA, 50µM, podría funcionar en muestras reales de agua de consumo de la red de la ciudad de Valencia.
Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla:
Tabla 1- Efecto del PMA (concentración 50 µM) en las señales de amplificación en la qPCR para Legionella spp
aLos valores de CP corresponden a la media + desviación estándar (n=3)
b ∆Cp: Cp Vivas con PMA – Cp Vivas sin PMA
c ∆Cp: Cp Muertas sin PMA – Cp Vivas sin PMA
d ND: no detectadas, inhibición completa por el PMA
La tabla se resume indicando que en muestras inoculadas con células muertas tratadas con el PMA no hay amplificación de DNA y en las muestras inoculadas con células vivas tratadas con PMA, la acción que ejerce sobre ellas el PMA es despreciable.
Legionella pneumophila (aguas de red)
Estas mismas pruebas, las realizaron en el caso de Legionella pneumophila y los resultados igualmente eran óptimos para las concentraciones celulares habituales que puede haber en un agua de red aunque, para altas concentraciones de células, todavía se se está en fase experimental.
Tanto Elías Colom como Adela Soriano aseguran, a la vista de los notables resultados obtenidos, que el método empleado funciona bien, sintiéndose orgullosos de esta pionera investigación, realizada desde el laboratorio yque ponen al servicio de la comunidad científica porque como asegura el director general ‘‘La detección rápida de la Legionella puede ayudar a salvar vidas y sobre todo a mejorar la salud de las personas’’.
Como ya se ha mencionado, las principales aportaciones que ofrece la investigación de GAMASER, son las siguientes:
1- Mayor rapidez de respuesta a la hora de ofrecer resultados de Legionella si empleamos la qPCR viable combinada con PMA
2- Garantizar resultados correspondientes sólo a células viables
3- Un nuevo método alternativo al oficial que es más sensible y específico para ofrecer una mayor vigilancia del agua de red
GAMASER, a la vista de los resultados obtenidos, propone el método de la qPCR combinada con el PMA como alternativa eficaz y rápida para los ensayos cualitativos de Legionella spp en aguas de red. Desde su punto de vista, “el método oficial subestima los resultados positivos y ofrece un gran peligro por tener el riesgo de dar resultados falsos negativos, lo cual pone en peligro la salud pública. Es cierto que existe una propuesta al Real Decreto 865 que todavía no ha entrado en vigor, en la que se hace eco de los progresos técnicos y permitirán en empleo de la PCR para la toma de decisiones urgentes como en el caso de brotes o positivos, pero en ningún caso permiten la sustitución de sus datos por los de las técnicas de cultivo”.
